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    公开号:WO1992002619A1
    申请号:PCT/JP1991/001040
    申请日:1991-08-03
    公开日:1992-02-20
    发明作者:Yorimasa Suwa；Atsushi Imaizumi；Masahiro Okada；Yoji Suzuki；Ichiro Kudo；Keizo Inoue；Chieko Azuma；Makoto Murakami
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 炎症局所由来ホスホリパーゼ八2 阻害蛋白産生のためのプ ラスミ ド、 微生物細胞ならびにその蛋白の製造および使用
    [0002] 〔技術分野〕
    [0003] 本発明は炎症局所由来ホスホリパーゼ A z 阻害蛋白をコー ドする D N A断片を有する組換えプラスミ ド、 該プラスミ ド により形質転換された組換え微生物、 その微生物を用いた炎 症局所由来ホスホ " パーゼ A 2 阻害蛋白遺伝子発現による製 造方法に閩する。 また、 本発明は前記製造方法により製造さ れた蛋白を有効成分として舍んでなるァレルギ一反応抑制剤 にも関する。
    [0004] 〔背景技術〕
    [0005] 補体 C 3 (以下、 C 3 と称する） は補体活性化経路におい て中心的機能を果たすことが知られている蛋白である。 この C 3は血中の蛋白分解酵素によって段階的に分解される。 す なわち、 まず C 3 コ ンペルターゼにより切断されて C 3 a と C 3 b とを生じる。 C 3 bはチオールエステル部位を介して 異物表面と結合し、 それに引き続いて補体経路が活性化して 膜侵襲複合体の形成に至る。 また、 C 3 a はァナフイ ラ トキ シンとして働く。 C 3 bはその後さらに蛋白分解酵素により 切断されて最終的に C 3 d gまたは C 3 dを生じる。
    [0006] ホスホ リ パーゼ A 2 はリ ン脂質の β ェステル結合を加水分 解し、 脂肪酸とリゾリ ン脂質を生じる酵素である。 特に、 プ ロスタグラ ンジン、 ロイ コ ト リ ェン、 ト ロンボキサン等の前 駆体となるァラキ ドン酸を膜リ ン脂質から遊離させることか ら、 これらの炎症メディエーターの産生において重要な役割 を果たしていると考えられる。 近年、 ヒ ト炎症性疾患や炎症 モデル動物の局所からホスホリバーゼ八2 が精製され、 その 性状が明らかになつた。 この酵素は炎症反応を進展させる働 きを有すると考えられ、 したがつてこの酵素の活性を阻害す る薬物は抗炎症的な作用を示すことが期待される。
    [0007] 本発明者らはいち早く この酵素に着目し、 これを特異的に 阻害する蛋白の探索研究を行い、 ヒ トおよびラ ッ トの C 3 d gが炎症局所由来ホスホリバーゼ A2 を特異的に阻害する活 性を有することから、 C 3 d gが炎症局所においてホスホリ パーゼ A2 を阻害し、 その結果抗炎症的に作用する可能性が 在ることを見い出し既に出願している （特願平 1 一 200246号 および特願平 2 — 89085 号、 これらの出願は、 本願の優先権 主張の基礎となる特願平 2 — 205164号の出願後に国際公開さ れた W O 9 1ノ 0 1 9 9 9に対応する） 。
    [0008] しかしながら、 C 3 d gの抗炎症作用についての評価を行 い、 さらに将来これを抗炎症薬として開発していく ためには 大量の精製蛋白を得る必要がある。 これまで C 3 d gを得る 方法として知られているのは、 血清を 3 7て処理するか、 あ るいは精製した C 3をファ クター（Factor) I等の蛋白分解酵 素で処理後、 各種 H P L Cを用いて C 3 d gを抽出精製する 方法 （特開平 2 — 91100 号公報参照） のみであるが、 これら の方法では得られる精製蛋白の量に限りがあり、 前述の目的 には適さない。
    [0009] そこで本発明者らは、 このような問題点を解決するため鋭 意検討の結果、 遺伝子組換えの手法により、 ラ ッ トおよびヒ トの C 3 d g部分を舍み C 3 d g と同等のホスホリパーゼ A 2 阻害活性を有する蛋白を大量に生産する方法を知見し、 本発 明に到達したものである。
    [0010] 上述のごと く、 本発明の蛋白は炎症局所由来ホスホリパー ゼ A z を特異的に阻害するこ とより特定の症病に対する予防 または治療薬としての興味がある。 一方、 近年ますます症例 数が増加する傾向にある喘息や麻疹等のァレルギ一症状に対 するより有効な薬物提供の必要性は依然として存在する。
    [0011] ところで、 アレルギー反応は、 いわゆる即時型アレルギー 反応と遅延型アレルギー反応に 2分され、 この肥満細胞が即 時型アレルギーの成因に関与することが知られている。 これ は肥満細胞が細胞膜表面上に高親和性 I g E受容体を持ち、 抗原刺激に応じてヒスタ ミ ン、 セ ロ トニン等の顆粒内容物を 放出する こ と （脱顆粒） による。 したがって、 この肥満細胞 活性化を抑制する薬物は、 喘息や麻疹等のァレルギ一症状を 改善する効果を示すことが期待できる。 そこで本発明者らは、 炎症局所由来 P L A 2 阻害蛋白について鋭意検討の結果、 驚 く べきこ とに炎症局所由来 P L A 2 阻害蛋白が、 肥満細胞か らの脱顆粒を阻害することを知見してもう一つの本発明に到 達したものである。 〔発明の開示〕
    [0012] 本発明は、 炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 阻害蛋白をコ ードする D N A配列と、 該蛋白の発現調節を行うプロモータ 一機能を有する D N A配列とからなるプラスミ ドを提供する, また、 かかるプラスミ ドによって形質転換された組換え微生 物細胞、 さらにこの組換え微生物を炎症局所由来ホスホリパ ーゼ A2 阻害蛋白を生成するまで栄養培地で培養し、 この培 養物からこの炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白を採 取することを特徴とする炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻 害蛋白の製造方法、 ならびにかかる製造方法で製造された炎 症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害蛋白を提供する。 さらに また、 かかる阻害蛋白、 あるいは哺乳動物の器官もしく は体 液から単離 · 精製されたかまたは哺乳動物の補体 C 3から分 解調製された炎症局所由来ホスホリパーゼ八2 11害剤のいず れかを舍んでなるァレルギ一反応抑制剤を提供する。
    [0013] 〔図面の簡単な説明〕
    [0014] 第 1図は、 ラ ッ ト C 3 or融合蛋白発現ブラスミ ドの構築の 概略図である。
    [0015] 第 2図 （ a ) および （ b ) は、 ラ ッ ト M e t — C 3 d g発 現プラスミ ドの構築の概略図である。
    [0016] 第 3図 （ a ) および （ b ) は、 ヒ ト M e t — C 3 d g発現 ブラスミ ドの構築の概略図である。
    [0017] 第 4図 （ a ) および （ b ) は、 実施例 5におけるゲル濾過 H P L C画分の蛋白溶出ピークおよび溶出画分の S D S— P A Gを示す。
    [0018] 第 5図は、 実施例 7における融合蛋白のラ ッ ト炎症局所由 来ホスホリバーゼ A2 阻害活性を示す。
    [0019] 第 6図は、 実施例 8における融合蛋白のヒスタ ミ ン遊離率 (%) を示す。 図中、 會はコ ン トロールを〇は前記融合蛋白 を示す。
    [0020] 〔発明を実施するための最良の形態〕
    [0021] 本発明において， 炎症局所由来ホスホリバーゼ八2 阻害蛋 白をコー ドする D NA配列とは、 ラ ッ トまたはヒ ト補体 C 3 の分解物である C 3 d gの全ァ ミノ酸配列をコードする D N A配列、 あるいはこれらのァ ミノ酸配列において発現に際し 前記ホスホリパーゼ八2 阻害活性を消失することなく 1以上 のァミノ酸残基が置換、 欠失もしく は新たに挿入されたァ ミ ノ酸配列を含む蛋白をコードする D N A配列をいう。 ラ ッ ト またはヒ ト C 3 d gの全ァ ミノ酸 K列またはそれらをコード する D N A配列の一例は、 本発明者等の発明に係る国際出顢 P C TZ J P 9 0 / 0 0 9 6であって、 本特許出願の優先権 の基礎となって出願 （特願平 2 — 205164号、 1990年 8月 3 日 出願） 後に国際公開された W O 9 1 / 0 1 9 9 9明細書に記 載されている。 なお、 その内容は引用することにより本明細 書の内容となる。
    [0022] このようなァ ミノ酸配列は、 配列番号 1 および 3 によって 具体的に示される。 かかるア ミノ酸配列をコー ドする D N A 配列の一例としては、 配列番号 2および 4によって具体的に 示され、 ラ ッ トおよびヒ トに由来する、 それぞれ 1 0 3 2個 および 1 0 4 7個の塩基からなるものが挙げられる。 また、 これらの D NA配列を用いて本発明のプラスミ ドを構築する 場合、 その発現によって産生される前記ホスホリバ一ゼ A 2 阻害蛋白が実質的にその活性を消失しない限り、 その上流お よび/下流に追加の D N A配列を伴う ものも前記阻害蛋白を コードする D N A配列に包舍される。 追加の D N A配列は、 一般的に、 目的の D NA配列をクローニングする際に随伴す る可能性のあるものである。 従って、 例えば、 第 1〜3図で 例示されるようなプラスミ ドの構築過程で調製されるラ ッ ト またはヒ ト C 3 d gをその 1部としてコードする D NA配列 も本発明の炎症局所由来ホスホリバーゼ 2 阻害蛋白をコ一 ドする D N A配列に包舍される。 これらの具体的なものとし ては、 ラ ッ ト肝 c D N Aス g t 1 1 ライブラ リ一に由来する 2. 1 kbp の D NA断片であって、 前記 D N A断片が、 c D N A λ g t 1 1 ライブラリーを E c o R I で消化して得られる 2.0 kbp の D NA断片と、 もう一つの 0.7 kbp の D N A断片 を B a m H Iで消化して得られる 0. 1 kbp の D N A断片から 再構築される D N A配列、 さらにこの D N A配列から E c o R I および F o k I消化するこ とによって得られる 1.0 kbp の E c o R I — F o k l断片の上流域に開始コ ドンとラ ッ ト C 3 d g遺伝子の 5 ' 末端約 6 0 bpをつなげて調製した 2本 鎖 D N Aをライゲーシヨ ンし、 さらに下流域に終止コ ドンと ラ ッ ト C 3 d g遺伝子の 3 ' 末端約 2 0 bpをつなげて調製し た 2本鎖 D N Aをライゲ一ショ ンして再構築される D N A配 列、 ならびにヒ ト c D NAクローン P H L C 3. 1 1を E c o R Iおよび K p n Iで消化して得られる約 1.2kbの E c o R
    [0023] I - K p n I断片の上流域に、 開始コ ドンと C 3 d g遺伝子 の 5 ' 末端約 7 0 bpをつなげて調製した 2本鎖 D NAの N c
    [0024] 0 I - E c 0 R I断片をライゲーシヨ ンし、 さらにこの D N A断片を E c 0 T 1 Iで部分消化して得られる約 0.9 7 kb の N c o l — E c o T 1 4 I断片の下流域に、 ヒ ト C 3 d g 遺伝子の 3 ' 末端約 8 0 bpと終止コ ドンをつなげて調製した 2本鎖 D NAの E c o T 1 4 I — K p n l断片をラィゲ一シ ョ ンして再構築した D Ν Α配列を挙げることができる。 すな わち、 本発明のプラスミ ドの構築に用いることのできる炎症 局所由来ホスホリパーゼ A2 (以下、 「 P L A2 」 と称する こともある） 阻害蛋白をコードする D NA配列を概念的に示 せば次のようなものが挙げられる ：
    [0025] ( i ) 開— P L A2 · D NA—終 ；
    [0026] ( ii ) 開—シグナル · D N A— P L A 2 · D N A—終 ；
    [0027] ( iii ) 開一 a ' D NA— b ' D NA— P LA2 ' D NA—終 および
    [0028] ( iv ) 開一シグナル ' D NA— a · D NA— b · D NA—
    [0029] P L A2 ' D NA -終。
    [0030] (上記で、 開は開始コ ドンであり、 P L A2 · D N Aは P L A2 阻害蛋白をコー ドする D N A配列であり、 終は終止 コ ドンであり、 シグナル ' D N Aはシグナルペプチ ドをコー ドする D NA配列であり、 a ' D NAは P L A2 阻害蛋白を 宿主細胞内で大量に発現するための付加的ポリ ペプチ ドをコ ードする D NAであり、 そして b · D N Aは開裂配列べプチ ドをコードする D N A配列である。 なお、 上記各用語は当該 技術分野で通常使用されている意味を表わす。 ）
    [0031] 本発明において、 該蛋白の発現調節を行うプロモーター機 能を有する D N A配列としては、 ラク トース ' オペロ ン
    [0032] ( l a c ) プロモーターおよびその改変体 （例えば、 1 a c UV 5 ) 、 ト リ ブ トファ ン （ t r p ) プロモーター、 t r p — 1 a cのハイブリ ッ ドプロモーター （例えば、 t a c , t a c II , t r c ) 、 スファージ PL プロモーターおよび PR プロモーター、 T 7プロモーター、 テ ト ラサイ ク リ ン耐性遺 伝子 ( t e t ) プロモーター、 t r p - t e tおよび 1 a c — t e tノヽイブリ ッ ドプロモーター、 ^—ラクタマーゼプロ モーター、 大腸菌外膜タンパク遺伝子 （ 1 P P ) プロモータ 一、 合成プロモーター （例えば、 E.coli trpプロモーター、 オペレーターを舍む 8 2塩基 DNA) 等が挙げられる。 これ らのうち、 特に 1 a cプロモータ一を好ましいものとして挙 げることができる。
    [0033] 本発明のプラスミ ドを調製する際に用いるこ とのできるベ クタ一としては、 それ自体既知または市販のベクター類をそ のまま、 あるいはそれらを使用目的に応じて誘導したものを 挙げることができる。 例えば、 上述のプロモーター配列、 シ ャ イ ン . ダルガーノ （ S D ) 配列およびターミ ネーター等の 要素が予め組み込まれている発現べクタ一が都合よ く使用で きる。 また、 他の組み込まれてもよい要素としては、 上記シ グナルぺプチ ドをコ一ドする D N A配列が举げられ、 例えば 大腸菌を宿主とする場合には、 アルカ リ性フォスファターゼ
    [0034] O m p F、 プロテイ ン A、 ^ーラクタマーゼ （ぺリ シリ ナ一 ゼ） 、 リ ボプロテイ ンおよびエン ド トキシンなどのシグナル ペプチ ドをコー ドする D N A配列が挙げられる。
    [0035] 大腸菌内発現プラス ミ ドと しては、 P B Rシリーズ、 p U Cシリーズ等の C 0 1 E 1 系ブラス ミ ド、 p A C Y Cシリ —ズ等の P 1 5 A系プラス ミ ド、 m i n i Fベクター等の F 因子系ブラス ミ ド、 P S C 1 0 1等の R因子系ブラス ミ ド、 p U C l 1 8 , 1 1 9等のファージ由来プラス ミ ドを挙げる ことができる。 これらのなかでも l a cプロモーター、 S D 配列、 翻訳開始コ ドン、 ク ローユングサイ ト、 ターミネータ —をこの順で舍む、 P T V 1 1 8 N, p T V 1 1 9 N等が特 に好ま しい。
    [0036] 従って、 本発明のブラス ミ ドの具体的なものと しては、 前 記ベクターのク ローニングサイ トに P L A2 阻害蛋白をコー ドする D N A配列を舍んでなる ものが举げられ 、 好ま しい ものと しては P P T C 3 Z2. 1、 丁 1¾ 〇 3 / 1.0 3 5ぉょ び P T H C 3 / 1. 0 5 0を挙げることができる。 これらのブ ラス ミ ドは、 これらを用いて常法により、 Eschericia coli JM109 を形質転換した組み換え微生物細胞であって、 日本国 の通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄 託センターに国際寄託され、 F E R M B P— 3 0 2 7 ( 1 9 9 0年 4月 2 6 日寄託の F E R M P— 1 1 4 3 1から国 際寄託に移管） 、 F E R M B P - 3 4 8 5 ( 1 9 9 1年 7 月 1 7 日寄託） および F E R M B P— 3 4 8 6 ( 1 9 9 1 年 7月 1 7日寄託） の大腸菌、 それぞれ P T C 3 Z2. 1 , J 9 T R C 3 / 1.0 3 5および J 9 T H C 3 / 1.0 5 0菌株か ら常法により得ることができる。
    [0037] これらのプラスミ ドを始めとする本発明のブラスミ ドは、 上述のベクターのクローユングサイ トに P L A2 阻害蛋白を コードする D N A配列を挿入する、 例えば第 1 , 2 ( a ) (b および 3 ( a ) (b ) 図のいずれかのプラスミ ド構築手順に準 じて調製することができる。 これらの各工程はそれ自体既知 の方法で実施できる。
    [0038] 本発明の組換え微生物細胞は、 前述のようにして得られた ブラスミ ドで微生物細胞を形質転換することによって得られ る。 この形質転換に際しては C a C 1 2 法を用いることが好 ましい。
    [0039] また、 組換え用の宿主細胞としては、 例えばェシエリ ヒア (Eschericia) 属、 ノヾチルス（Baci 1 lus)属、 サッカロマイセ ス（Saccharomyces) 属等に属する微生物細胞を挙げることが できる。 これらのなかでも Eschericia属の微生物細胞、 なか でも特に Eschericia coli JM109 が好ましいものとして挙げ られる。
    [0040] 従って、 本発明の組換え微生物細胞の具体的なものとして は、 上述の好ましい本発明のプラスミ ドで形質転換した大腸 菌 P T C 3ノ 2. 1 ( F E R M B P— 3 0 2 7 ) 、 J 9 T R C 3 / 1. 0 3 5 ( F E R M B P— 3 4 8 5 ) および J 9 T H C 3 / 1.0 5 0 ( F E R M B P— 3 4 8 6 ) を挙げるこ とができる。 上記組換え微生物細胞は炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 阻害活性を有する蛋白質の製造に使用できる。
    [0041] すなわち、 本発明はまた、 前記組換え微生物細胞を栄養培 地で炎症局所由来ホスホリバーゼ A2 阻害蛋白 （ P L A2 阻 害蛋白） を生成するまで培養し、 培養物から P L A2 阻害蛋 白を採取する P L A2 阻害蛋白の製造方法も提供する。 培養 は大腸菌の培養に通常用いられる条件下で行ない、 その栄養 培地も、 通常の炭素源、 窒素源、 その他の無機塩および微量 栄養素を用いて行う ことができる。 こう して P L A2 阻害蛋 白は、 菌体内に封入体として大量に蓄積されるか、 また上述 のようなシグナルペプチ ドをコードする D N A配列を用いる と菌体外に蓄積される。
    [0042] かかる培養物から P LAZ 阻害蛋白を採取するには、 前者 にあっては、 微生物細胞に適当な溶菌処理、 例えば細胞壁溶 解酵素処理または超音波処理を施して溶菌した後、 また、 後 者にあっては菌体を除去した後、 それ自体既知の蛋白分離精 製方法を実施すればよい。 より具体的には、 前者は、 集めた 菌体を例えば超音波破砕等により封入体を回収し、 この封入 体を尿素等によって可溶化し、 ゲル濾過力ラムを用いて尿素 を除き、 得られる蛋白をピリ ジルェチル化して S H基保護を する。
    [0043] 次いで、 S H基保護された蛋白をゲル濾過 H P L Cで分画 し、 C 3 α遺伝子由来の組換え蛋白を主成分とする画分を得 る。
    [0044] 本画分をラ ッ ト炎症局所由来ホスホリパーゼ Α2 に対する 阻害活性を指標にして、 逆相 H P L C等によりさらに単離 · 精製する。
    [0045] 前記阻害活性または阻害蛋白は、 例えば次のように測定ま たは追跡することができる。
    [0046] ( A) 炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 阻害活性の測定法
    [0047] 酵素としてカゼイ ン誘導ラ ッ ト腹腔浸出液より単離 - 精製したホスホリパーゼ A 2 を用い、 基質としては" C —酢 酸と共に培養した E.Coliより抽出、 精製した14 C 一ホスファ チジルエタノールア ミ ン （約 2 , 0 0 0 dpm /nmol, 0. 1 mM) を用いた。
    [0048] 酵素反応は、 5 0 の 0. 5 M T r i s · C 1 (pH9. 0 ) 、 2 5 の 4 O raM C a C 1 2 、 2 の基質にサンプルおよ び水を加えて総量 2 4 0 として混合し最後に 1 0 の酵素 液 （ 0. 1 ng/≠ ) を加え、 3 7てにて 1 0分間反応させたの ち、 D 0 1 e ' s試薬 （ 1. 5 ml) を加えて反応を停止し、
    [0049] D o l eの方法に従って生成した1 < C 一脂肪酸を抽出し、 液 体シンチレーショ ン · カウ ンターで測定する。
    [0050] ( B ) S D S —ポリアク リルァミ ド電気泳動およびゥエスタ ン · ブロ ッテイ ング
    [0051] 培養処理物または各精製工程により得られるサンプル に 1 Z 1 0量の色素液 （ 0. 1 % B P B , X C , 1 0 % S D S ) を加え、 1 0 0 'C 5分間熱処理後、 1 2. 5 %ポリ アク リ ルァ ミ ドゲルにアプライ し、 1 % S D S存在下、 1 5〜 2 5 mAで 1. 5時間電気泳動を行う。 還元状態での解析のためにはサン プルに 2 —メルカプ トエタノール （ 2 ME) を加える。 泳動後、 1 1
    [0052] 13 蛋白の検出のために C B Bで染色する。
    [0053] また、 同様に泳動した後ミ リポア社エレク トロプロ ッティ ング装置を用いて、 蛋白をゲルから二 ト ロセルロース · フィ ルターに移し、 抗ヒ ト C 3 d ヒッジ血清 （ Dako ) 、 西洋ヮサ ビ · ペルォキシダーゼ結合抗ヒッジ I g G抗体（Cappe l )およ び基質として 4 —ク ロ口 一 1 —ナフ トール （ B i 0 — R a d ) を用い、 酵素抗体染色法により C 3 dのバン ドを検出するこ とができる。
    [0054] このようにして製造された炎症局所由来ホスホ リバーゼ A 2 阻害蛋白は、 例えば、 配列番号 1 または 3示されるア ミノ酸 配列を主要配列として舍んでなる蛋白であり、 後述するよう に炎症局所由来ホスホリパーゼ八2 に対し特異的に強い阻害 活性を有すると共に、 アレルギー反応抑制作用も有すること が確認された。 また、 かかるア レルギー反応抑制作用は、 炎 症局所由来ホスホリパーゼ A z を特異的に阻害することが知 られている蛋白、 例えば特開昭 63— 246397号公報に記載のラ ッ ト腹腔由来の蛋白、 特開平 2 - 91100 号公報記載のヒ ト補 体 C 3酵素処理で調製された蛋白、 国際公開 W091 / 1999明細 書記載のラ ッ トもしく はヒ ト血清由来の蛋白、 にも同様に確 認された。 かかる作用は、 これらの阻害蛋白が、 驚くべきこ とに、 肥満細胞由来の脱頼粒を阻害するとの知見に基づく。 従って、 本発明のもう一つの態様は、 炎症局所由来ホスホ リパーゼ A 2 阻害蛋白を有効成分として舍んでなるア レルギ 一反応抑制剤に関する。 前記阻害蛋白には本発明の遺伝子ェ 学的手法によって得られるものを初め、 前記哺乳動物から単 離 · 精製されるもの、 および捕体 C 3から調製されるものも 舍まれる。
    [0055] 本発明におけるァレルギ一反応とは、 抗原感作された生体 が再度同種抗原がはいつた時に起こす反応を言い、 なかでも. 肥満細胞によつて誘起されるアナフィ ラキシー、 ァルッス反 応等の即時型アレルギー反応をいう。 対象となる哺乳動物、 特にヒ トの具体的な疾患としては、 喘息および麻疹が挙げら れる。 本発明においては、 該 P L A 2 阻害蛋白を有効成分と し、 既知の方法で適当な賦形剤等を用いて軟カプセル剤、 硬 カプセル剤、 錠剤、 シロ ップ剤等の経口剤、 注射剤、 または 外用剤として使用できる。 有効成分の投与量は、 通常 1〜 5 0 O mgノ日ノ人程度であり、 投与回数は通常 1〜 3回/日で あり、 このような条件を満足するように製剤を調整するのが 好ましい。 なお、 この投与範囲内で前記有効成分は哺乳動物 に対する急性毒性を示さない。 本発明の抑制剤は、 既存の薬 剤と併用することも可能である。
    [0056] 本発明の P L A 2 阻害蛋白のァレルギ一反応抑制剤として の効果は、 以下の試験により確認することができる。
    [0057] ( C ) ラ ッ ト C T M Cの I g E—抗原、 リゾ P S依存的活性 化に対する阻害効果 （ヒスタミ ン遊離抑制） の測定
    [0058] ( 1 ) ラ ッ ト結合組織型肥満細胞 （ C T M C ) の調製法
    [0059] 雄ウィスターラ ッ ト （体重 5 0 0 g以上） の腹腔に 1 0 ノ m lのへバリ ンを舍むハンクス液 5 0 m lを注入し、
    [0060] 1 0 0回以上マッサージする。 開腹してハンクス液を回収す る。 細胞を 1 0 0 xgで 5分間遠心して集め、 1 m lのハンクス 液に懸濁した後、 4 0 %ゥ シ血清アルブ ミ ン （ B S A ) を溶 かしたハ ンク ス液 5 mlに静かに重層し、 4 5 0 xgで 2 0分間. 4てで遠心する。 最下層の細胞を回収し、 ハ ンク ス液で洗浄 し、 腹腔肥満細胞を得る （純度 9 0 %以上） 。 ラ ッ ト 1匹あ たりから約 1 06 細胞が得られる。
    [0061] ( 2 ) ラ ッ ト C T M Cの活性化法
    [0062] 得られた腹腔肥満細胞を 0. 1 %ゼラチンを舍むハ ン クス液に再懸濁し （ 5 X 1 0 b ノ i»l) 、 抗 D N P I g E抗 体（Miles社） 1 /mlを添加し、 細胞を受動感作する。 細胞 を洗浄し、 0. 1 %ゼラチンを含むハンクス液に細胞濃度 1 一 2 X 1 06 ノ mlになるように再魅濁する。 ここに、 適当量の 抗原、 DNP 一 Ascharis (Eisen らの方法 J . Am. C h e m. S o c . , 7 5、 4 5 8 3 ( 1 9 5 3 ) に記載の方法により 調製） および 1 0— 6 Μのリ ゾホスファチジルセ リ ン（Avan ti 社） を添加し、 3 7 'Cで 1 0分間イ ンキュベー ト し、 細胞を 活性化する。 E D T Aを 2 «Μになるように添加して反応を止 める。
    [0063] ( 3 ) 活性化ラ ッ ト肥満細胞より放出される ヒスタ ミ ンの 定量法
    [0064] a ) ヒスタ ミ ン N—メ チル ト ラ ンスフェ ラーゼ （ H M T ) の調製
    [0065] S Dラ ッ ト （ 2 0 0 g ) の腎臓を湿重量の 9倍容の 0. 2 5 Mショ糖溶液中でホモジナイ ズし、 4 0 , 0 0 0 xgで 1時間遠心する。 上清に硫安を添加し、 4 5 %— 7 0 %硫安 沈殺画分を回収する。 0. 1 Mリ ン酸緩衝液 （PH7. 4 ) に溶か し、 0.0 1 Mリ ン酸緩衝液 （PH 4 ) に対して透折する。 こ の標品を H MTとして用いる。
    [0066] b ) ヒスタ ミ ン定量
    [0067] ヒスタ ミ ンを舍むサ ンプル （ 1 9 一 5 0 ) を試験 管に取り、 ここに適当量の HMTおよび 1 の 3H ( ト リ チ ゥム） 標識 S—アデノ シルメ チォニン （New England Nuclear) を加え、 0. 1 Mリ ン酸緩衝液 （PH7.9 ) で全容量を 2 0 0 W に合わせる。 3 7 'Cで 9 0分間イ ンキュベー ト した後、 1 0 0 Wの 2.5 N N a 0 Hを加えて反応を止め、 更にクロロホ ルム 2 mlを添加して、 生成した 3H—メ チルヒスタ ミ ンをク ロロホルム層に抽出する。 室温で 5分間遠心して水層とクロ 口ホルム層を分離し、 水層を除く。 残ったク ロ 口ホルム層に 2.5 N N a 0 H 2 0 0 を添加し、 再度抽出操作を行いク ロロホルム層を洗浄する。 得られたクロロホルム層の一定量 をバイ アル瓶に分取し、 ドライヤーで乾固させた後、 トルェ ン系シ ンチレーターを加えて放射活性を力ゥ ン トする。
    [0068] 〔実施例〕
    [0069] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 これにより本発明の範囲は限定されない。
    [0070] 例 1 (参者例） ラ ッ ト炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害 蛋白遣伝子のクローニング
    [0071] ( A ) マウス C 3 c D NA断片の調整
    [0072] マウ ス C 3 c D NA断片を舍むプラ ス ミ ド P F C 4 /5.4 ( J . B . C. 2 6 0 , 1 0 9 3 6 1 9 8 6 ) の H i n d不消化物から、 低融点ァガロースゲル電気泳動にて 2.2 kbp 断片を分離した。 また S t u I消化物からも同様な 操作で 1.8 kbp 断片を得た。
    [0073] ( B ) c DNAのスク リーニング
    [0074] ラ ッ ト肝 c DNAス g t 1 1 ライ ブラ リ ー （ク ロ ン テ ッ ク社製） をスク リ ーニ ングの素材として用い、 ク ロ ンテ ッ ク社実験プロ トコールの記載に従ってスク リ一ユングした すなわち、 ス g t 1 1 ファージを感染させた E . c o 1 i Y 1 0 9 0株を 3 7て、 5時間培養して得られた約 5万偭 の形質転換体群を対象としてナイ ロ ンフィ ルターメ ンブレン にレプリ カ し、 0.5 M N a O H - 1.5 N a C 1につけ て D NAを変性させ、 1.5 M N a C 1 - 1 MM E DTAを 舍有する ト リ ス塩酸バッ ファー （PH 7. 2 ) で中和した。 その 後、 フ ィ ルターを風乾し、 ト ラ ンスイルミネーターにて紫外 線を 3分間照射して D N Aをフ ィ ルターに固定した β
    [0075] スク リーニング用プローブとしては、 上記 （ A ) で得られ たマウ ス C 3 c DNA断片を32 Pで標識したものを用いた。 上記被験フ ィ ルター上の形質転換体群をこのプローブにて 6 5てのハイ ブリ ダィゼーショ ンにより スク リーニングし、 オー ト ラジオグラムでの感光により判定したところ、 約 5万 個の形質転換体群の内 7個がポジティ ブク ローンであった。 これらのポジティ ブク ローンを各々 ス r C 3 / 1 1〜 1 7 と 命名した。
    [0076] これらのク ローンを E c o R I消化後、 ァガロースゲル電 気泳動を行いサザンハイ ブリ ダィゼーショ ンにより挿入遺伝 子断片の鎖長を解折した。 その結果、 7つのクローンのなか で / 1 r C 3 1 1 の挿入遺伝子断片が最も長く、 このクロー ンは E c 0 R I により 0.7 kbp と 2.0 kbp に切断される全長 2.7 kbp の挿入遺伝子断片を持つことが判明した。
    [0077] ( C ) ラ ッ ト C 3 c D N Aの塩基配列の決定
    [0078] λ r C 3 / 1 1 のファージ D NAを抽出した後、 E c 0 R I で切断して 0.7 kbp と 2.0 kbp の D N A断片を得 た。 この断片をシークェンシング用クローニングベクター P U C 1 9およびシークェ ンシ ング用フ ァ ージ M 1 3 M P 1 9 R F D N A (宝酒造） の E c 0 R I部位に挿入した。
    [0079] 0.7 kbp 断片はさらに B a m H I消化により得られた 0. 1 kbp 断片と 0.6 kbp 断片をシークェ ンシ ング用ベクター P U C 1 1 8の E c o R I , B a m H I二重消化物に揷入し、 両末 端から塩基配列を決定した。
    [0080] 配列解折は 7 — D E A Z A法 （Mizusawa,et.al,Nucreic Acid Res. 14, 1319, 1986) に従った。 2 kbp 断片について は確定した周辺部に対応したプライマーを順次合成して塩基 配列解折を進める Hoodらの手法（Hood, et. al, Anal . Biochem. 154, 353, 1986) を用いた。
    [0081] 以下、 上述の国際公開 WO 9 1 / 0 1 9 9 9明細書記載の 方法により塩基配列を決定したところ、 ラ ッ ト炎症局所由来 ホスホリパ一ゼ A2 阻害蛋白 （ C 3 d g ) 遺伝子の全塩基配 列と推定される全ァミノ酸配列は、 それぞれ配列表の配列番 号 3および 1 の通りであった。
    [0082] また、 ヒ ト炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害蛋白の遺 伝子の全塩基配列と推定される全ァ ミノ酸配列について、 同 様に決定したものを配列表の配列番号 4および 2に示す。 例 2 ： C 3 or発現ブラスミ ドの構築
    [0083] 構築の手順は第 1図に従った。
    [0084] 大腸菌発現ベクター P T V 1 1 9 N (宝酒造） を B a m H I及び E c o R I で切断した。 また、 ラ ッ ト C 3 c D N Aク ローン P T C 3 Z 1 1 は B a m H I及び E c o R I で切断後 ァガロースゲル電気泳動により精製した断片を分離し、 0. 1 kbの B a m H I — E c o R I断片および . 0 kbの E c o R I 一 E c o R I断片を回収した。
    [0085] 切断したベクターと 0. 1 kb断片についてラィゲーショ ン反 応を行い、 大腸菌 J M 1 0 9を形質転換後、 ア ンビシ リ ンプ レー ト上で培養し ト ラ ンスフォーマ ン トを得た。 ト ラ ンスフ オーマ ン トよりブラス ミ ド D N Aを抽出精製し、 該プラ ス ミ ドを P P T C 3 Z0. 1 と命名した。
    [0086] プラスミ ド P P T C 3 /0. 1 を E c o R I で切断し、 2. 0 kb断片と共にライゲーショ ン反応を行った。 同様にして トラ ンスフォーマン トからプラス ミ ド D N Aを抽出精製後、 ジデ ォキシ法により B a m H I切断部位から塩基配列を決定した < 塩基配列により 2. O kb断片が順方向に挿入されているプラ ス ミ ドを選び、 P P T C 3ノ 2. 1 と命名した。
    [0087] 以上の操作において、 ベクター D N A及び制限酵素は宝酒 造より購入した。 ァガロースゲルからの D N Aの回収、 及び ト ラ ンスフォーマ ン トからのブラ ス ミ ド精製には B I 0 1 0 1社の G E N E C L E A Nを用いた。 また、 ライゲーシ ョ ン反応は宝酒造のライゲーシ ヨ ンキッ トを用いた。 塩基配列 の決定は宝酒造の M l 3 P r i m e r R V— Nおよび 7 — D EA Z A S e q u e n c i n g K i tを用いて行つ た。
    [0088] ここで用いたベクター p T V l 1 9 Nは 1 a cプロモータ 一を有するため、 培地中に I P TGを加えるこ とによ り目的 蛋白の発現が誘導される。 P P T C 3ノ 2.1により発現する 蛋白は、 N端側に大腸菌^一ガラク トシダーゼの N末端部 1 6残基、 C端側にラ ッ ト C 3 α鎖の後半約 Ί 4 0残基を有 する融合蛋白であり、 分子量は約 8 0 kDa である。
    [0089] この融合蛋白は、 前記のように得られた P P T C 3 Z2. 1 を用い、 常法の塩化カルシウム法により、 Eschericia coli JM109 株を形質転換して得られる組換え微生物 P T C 3ノ 2.1株 （ F E RM B P— 3 0 2 7 ) を栄養培地.で培養する こ とによ り産生される。
    [0090] 例 3 ： ラ ッ ト M e t— C 3 d g発現ブラス ミ ドの構築
    [0091] 構築の手順は第 2図 （ a ) および （ b ) に従った。
    [0092] プラス ミ ド P P T C 3 Z2. 1を E c o R Iで切断し、 2.0 kbの E c 0 R I 一 E c 0 R I断片を得た。 さらにこれを F o k lで切断し、 1.0 kbの E c 0 R I — F 0 k I断片を得た。 ラ ッ ト C 3 d gの D N A配列に基き、 ラ ッ ト C 3 d g遺伝子 3 ' 末端 1 4 bpに蛋白合成終止コ ド ン T G Aをつなげた形の DNAを合成し、 ァニーリ ングを行い、 2本鎖の F 0 k I 一 B a η Πの合成 D N A断片として得た。 発現べクター p T V 1 1 9 N (宝酒造） を E c 0 R I、 及び B a η Πで切断し、 1. Okbの E c o R I — F o k l断片と、 F o k l — B a n ll の合成 D N A断片の 3分子間でライゲーショ ン反応を行い、 大腸菌 J M 1 0 9株を形質転換後ァンビシリ ン舍有 L B寒天 培地上で培養し、 ト ラ ンスフォーマ ン トを得た。 ト ラ ンスフ オーマ ン トよりプラスミ ド D NAを抽出、 精製し、 該プラス ミ ドを P T R C 3 Z 0.9 7 3と命名した。
    [0093] プラス ミ ド P T R C 3Z 0.9 7 3を N c o I , E c o R I で切断した。 ラ ッ ト C 3 d g遺伝子 5 ' 末端 5 9 bpの上流に 蛋白合成開始コ ド ン AT Gをつなげた D NAを合成し、 ァニ 一リ ングを行い、 2本鎖の N c 0 I 一 E c 0 R I断片として 得た。 この合成 D NA断片と切断した P T R C 3 Z0.9 7 3 についてライゲーショ ン反応を行い、 大腸菌 J M 1 0 9株を 形質転換後アンビシリ ン舍有 L B寒天培地上で培養し、 ト ラ ンス フ ォーマ ン トを得た。 ト ラ ンスフォーマ ン ト よ り プラ ス ミ ド D NAを抽出、 精製後、 ジデォキシ法により N c 0 I切 断部位の 2 6塩基上流及び B a η Π切断部位の 4 1塩基下流 から塩基配列を決定し、 蛋白合成開始コ ド ンと終止コ ド ンの 間に 1 0 3 2 bpのラ ッ ト C 3 d g c D N Aが挿入されている ブラスミ ドを P TR C 3 Z 1.0 3 5 と命名した。
    [0094] こう して得られた P T R C 3 / 1.0 3 5を用い常法の塩化 カルシウム法により上記 J M 1 0 9株を形質転換して J 9 T R C 3 / 1.0 3 5 ( F E R M B P— 3 4 8 5 ) を得た。 ここで用いたベクタ一 p T V l 1 9 Nは 1 a cプロモータ —を有するため、 培地中に I P T G (イ ソプロピルチオガラ ク トシ ド） を加えて上記形質転換体を培養することにより、 目的蛋白の発現が誘導される。 P T R C 3ノ 1.0 3 5により 発現する蛋白はラ ッ ト C 3 d g 3 4 4残基の N端にメチォニ ンのついたもので分子量は約 3 9 kDa である。
    [0095] 例 4 ： ヒ ト M e t— C 3 d g発現プラスミ ドの構築
    [0096] 構築の手順は第 3図 （ a ) および （ b ) に従った。
    [0097] 大腸菌発現ベクター P T V 1 1 8 N (宝酒造） を E c 0 R I、 及び K p n Iで切断した。 また、 A T C C (American Type Culture Col lection, U. S. A) より入手したヒ ト C 3 c DNAクローン p H L C 3. 1 1を E c o R I及び K p n Iで 切断後、 ァガロースゲル電気泳動により、 1.2 kbの E c 0 R I - K p n I断片を分離、 回収した。
    [0098] 切断したベクターと 1.2 kb断片についてラィゲーショ ン反 応を行い、 大腸菌 J M 1 0 9株を形質転換後、 アンビシリ ン 含有 L B寒天培地上で培養し、 ト ラ ンスフォーマン トを得た。 ト ラ ンスフォーマン トよりプラスミ ド DNAを抽出、 精製し、 該プラス ミ ドを P TH C 3 Z 1.2 4 0と命名した。
    [0099] プラスミ ド P T H C 3 Z 1.2 4 0を N c o I及び E c o R Iで切断後ァガロースゲル電気泳動により 4.4 kbの N c 0 I - E c 0 R I断片を分離回収した。 また、 報告されているヒ ト C 3 d g c D N Aの塩基配列にもとづき、 蛋白合成開始コ ドン A T Gの下流にヒ ト C 3 d g c DNA 5 ' 末端約 7 0 bp をつなげた D N Aを合成し、 アニーリ ングを行い、 2本鎖の N c 0 I - E c 0 R I断片として得た。
    [0100] 4.4kbの P T H C 3ノ 1.2 4 0由来断片と合成 D N A断片 についてライゲーショ ン反応を行い、 大腸菌 J M 1 0 9株を 形質転換後、 ア ン ビシ リ ン舍有 L B寒天培地上で培養し、 ト ラ ンスフ ォーマ ン トを得た。 ト ラ ンスフォーマ ン ト よ りブラ ス ミ ド D NAを抽出、 精製し、 該プラス ミ ドを P TH C 3ノ 1.3 1 7と命名した。
    [0101] プラスミ ド p T H C 3 / 1.3 1 7を K p η Iで完全に切断 後 E c 0 T 1 4 Iで限定的 （部分的） に切断後、 ァガロース ゲル電気泳動により、 4.0 kbの K p n l — E c o T 1 4 I断 片と分離、 回収した。 また、 ヒ ト C 3 d g c D NAの塩基配 列にもとづき、 ヒ ト C 3 d g c D NA 3 ' 末端約 8 Obpに蛋 白合成終止コ ドン TAGをつなげた D NAを合成し、 ァニ一 リ ングを行い、 2本鑌の E c 0 T 1 I - K p n I断片とし こ得た。
    [0102] 4. Okpの P T H C 3 /1.3 1 7由来断片と、 合成 D NA断 片について、 ラ イ ゲーシ ョ ン反応を行い、 大腸菌 J M 1 0 9 株を形質転換後、 ア ンビシリ ン舍有 L B寒天培地上で培養し. ト ラ ンスフ ォーマ ン トを得た。 ト ラ ンスフォーマ ン トよ り プ ラスミ ド D NAを抽出、 精製後、 ジデォキシ法により、 N c 0 I切断部位の 2 6塩基上流、 及び K p n I切断部位の 4 3 塩基下流から塩基配列を決定し、 蛋白合成開始コ ド ンと終止 コ ド ンの間に 1 0 4 7 bpのヒ ト C 3 d g c D N Aが挿入され ているプラス ミ ドを P T H C 3 / 1.0 5 0 と命名した。
    [0103] こう して得られた P T H C 3 / 1.0 5 0を用い、 常法の塩 化カルシウム法により前記 J M 1 0 9株を形質転換し、 組換 え微生物 J 9 T H C 3 Z 1.0 5 0 ( F E R M B P - 3 4 8 6 ) を得た。 ここで用いたベクター p T V l 1 8 Nは 1 a cプロモータ 一を有するため、 培地中に I P T Gを加えて前記形質転換体 を培養することにより、 目的蛋白の発現が誘導される。 P T H C 3 / 1.0 5 0により発現する蛋白はヒ ト C 3 d g 3 4 9 残基の N端にメ チォニンのついたもので分子量は約 3 9 kDa である。
    [0104] 例 5 ： 炎症局所由来 P L A2 阻害蛋白の大腸菌における発現 と発現蛋白の精製
    [0105] P T C 3ノ 2. 1 ( F E R M B P - 3 0 2 7 ) 、 J 9 T R C 3 / 1. 0 3 5 ( F E R M B P— 3 4 8 5 ) 、 または J 9 T H C 3 / 1.0 5 0 ( F E R M B P - 3 4 8 6 ) を、 5 0 /mlのア ンビシ リ ンナ ト リ ウムを舍む 2 X T Y培地 1 0 ml で 3 7 ΐで一晩培養後、 全量を 1 1 の同じ培地に移し、 3 7 •Cで培養を行い、 約 5時間後に 1 0 0 jt M I P T Gを加えて、 さらに約 3時間培養を続けた。
    [0106] それぞれの培養液の一部を取り、 2— M Eおよび S D Sを 加えた後、 S D S— P A G Eにて菌体蛋白を分離し、 B i o - R a d社エレク トロプロ ッティ ング装置を用いて、 ニ ト ロ セルロースフ ィ ルターへの転写を行った。 転写後のメ ンブレ ンを 3 %B S Aを含む 2 0 mM P B S ( PH 7.5 ) でブロ ッキ ングを行った後、 P T C 3 / 2. 1菌体蛋白の場合にはャギ抗 ラ ッ ト C 3血清 （ C A P P E L ) を、 J 9 T R C 3ノ 1.0 3 5および J 9 T H C 3 / 1, 0 5 0菌体蛋白の場合にはゥサギ 抗ヒ ト C 3 d血清 （ D A K O ) を、 それぞれ 1 %B S Aを舍 む P B Sで 1 0 0倍希釈したものと、 4てで 4時間反応させ た。 これらを P B Sで洗浄後、 P T C 3ノ 2. 1 の場合にはブ タ抗ャギ I g G抗体一 H R P 0複合体 （ T A G 0 ) を、 J 9 T R C 3ノ 1. 0 3 5および J 9 T H C 3 Z 1. 0 5 0 の場合に はヒッジ抗ゥサギ I g G抗体一 H R P 0複合体 （ B i 0 — R a d ) をそれぞれ 1 % B S Aを舍む P B Sで 5 0 0倍希釈し たものと、 4てで 2時間反応させた。 これらを、 P B Sにて 3回洗浄後、 コニカイムノ スティ ン H R Pキ ッ トを用いて染 色した。 その結果、 P T C 3ノ2. 1 においては、 分子量約 8 0 k D a のラ ッ ト C 3 α融合蛋白が、 J 9 T H C 3 . 0 5 0においては分子量約 3 9 k D aの M e t — ヒ ト C 3 d gが- また J 9 T R C 3 Z 1. 0 3 5においては分子量約 3 9 k D a の M e t —ラ ッ ト C 3 d gがそれぞれ発現していることが確 認された。
    [0107] P T C 3 Z 2. 1 については、 さらに 3 , 0 0 0 G、 5分間 の遠心分離操作により菌体を集め、 4 0 mlの 5 0 nil T r i s · H C 1 (pH7. 5 ) 緩衝液に懸濁した後、 超音波処理を行 い （クボタ INS0NAT0R201M 、 最大出力にて約 5分間） 菌体を 破壊した。 3 , 0 0 0 G、 1 0分間の遠心分離操作により封 入体を回収し、 これに 1 0 mlの 8 M尿素— 1 0 O BIMト リス塩 酸緩衝液 （PH8. 0 ) を加えて 3 0分間室温に置き、 封入体蛋 白を可溶化した。 1 0 , 0 0 0 G、 1 0分間の遠心分離操作 により不溶物を取り除いたのち、 尿素を除く ためゲル濾過力 ラム （フ ア ルマ シア社 P D 1 0 カ ラム） にアブラ イ し 1 0 mM 酢酸ア ンモニゥムにて溶出した後、 凍結乾燥した。
    [0108] 凍結乾燥サ ンプル約 3 O mgを 1 % S D Sを舍む 2 mlの 0. 2 M酢酸ェチルモルフォ リ ン （PH 8. 0 ) に溶解し、 2 の 2 — メルカプトエタノール （ 2 ME) を加え室温にて 3 0分間放置 した。 新たに 2 Wの 2 MEを加え室温にてさらに 3 0分間放置 した後、 3 Wの 4 一ビュルピリ ジンを加え室温 1時間反応さ せた。 さらに 3 /rf の 4 —ビュルビリ ジンを加え室温で 1時間 反応させた後、 直ちにゲル濾過 H P L C ( T S K g e l G 3 0 0 0 S W) にアブライ した。 溶出は 5 0 mM T r i s · H C 1 - 1 5 0 mM N a C 1 (pH7. 5 ) 、 0. 5 rol/min で行 つた。
    [0109] ゲル濾過 H P L C画分を S D S— P A G Eで解折したとこ ろ、 8 O kDa の融合蛋白は 2 4番目の面分を中心として溶出 していることが判った 〔第 4図 （ a ) および （ b ) 〕 。 この 画分をさらに逆相 H P L C (Vydac，ProteinC4)で精製し、 最 終サンプルとした。
    [0110] 1 £の大腸菌培養液から精製された蛋白量は約 6 0 0 /«で あった。
    [0111] 以上の操作において、 H P L Cは Spectra- Physics ポンプ システム S P 8 7 0 0、 応用分光 U Vディテクター U V I L 0 G - 5 I A. L K Bフラク ショ ンコ レクター 2 1 1 2、 及 び R e 0 d y n e サンブルィ ンジェクタ一 7 1 2 5を用いた S D S— P A G Eは 5〜2 0 %グラジェン トゲル （A T T O パジヱル） を用いて行い、 C B B (sigma)にて染色した。 例 6 ： 精製蛋白の同定
    [0112] ( 1 ) 免疫化学的手法による同定
    [0113] 前記ゲル濾過 H P L C画分を S D S - P A G Eで分離後、 ゲルを 2 0 %メ タノ ールを舍む 2 5 mMト リ ス塩酸一 1 9 2 mM グリ シ ン緩衝液中で 3 0分間振盪した後、 B i 0 — R a d社 エレク トロブロ 'ンティ ング装置 （ ImiBuno Bio t)を用い、 二 ト ロセルロースメ ンブレンへの転写を行った （ 0. 5 A、 3 0分 間） 。
    [0114] 転写後のメ ンブレンを 3 % B S Aを舍む 2 0 mMP B S (PH 7. 5 ) 中で 1時間振盪してブロ ッキングを行った後、 1 % B S Aを舍む 2 0 mMP B Sで 1 0 0倍稀釈したャギ抗ラ ッ ト C 3抗体 （CAPPEい と 4 'Cで 4時間反応させた。
    [0115] 1 %T w e e n — 2 0を舍む P B Sで 3回洗浄後、 1 %B S Aを舍む P B Sで 5 0 0倍稀釈したブタ抗ャギ I g G抗体 — H R P 0複合体 （ T A G 0 ) と 4てで 2時間反応させた。 l %T w e e n - 2 0を舍む P B Sにて 3回洗浄した後、 コ 二カイムノ スティ ン H R Pキ ッ トを用いて染色した。
    [0116] この結果、 # 2 4を中心として溶出している 8 O kDa 蛋白 のバン ドは抗ラ ッ ト C 3抗体と反応し、 目的の融合蛋白であ ることが確認された。
    [0117] ( 2 ) N末端ァミノ酸配列の決定
    [0118] 逆相 H P L Cで精製した最終サ ンプルを真空遠心濃縮装置 を用いて乾燥後、 8 0 %ァセ トニ ト リ ル— 0. 1 %T F Aに溶 解して気相プロティ ンシークェンサ一（Applied Biosystems 社 477 A)にアプライ し、 N末端アミノ酸配列を決定した。
    [0119] その結果、 8 O kDa 融合蛋白の N末端ア ミノ酸配列は以下 の配列であることが判明した。
    [0120] NH^-Ala-Met-Ile-Thr-Pro-X-Ser- この配列は大腸菌 /S—ガラク トシダーゼの N末端から 1番 目の M e t のみが欠けたものと一致した。 目的の 8 0 kDa 融 合蛋白が合成された後なんらかの機構により N末端の M e t が切断されたものと考えられた。
    [0121] 例 7 ： C 3 or鎮融合蛋白のホスホリバーゼ八2 阻害活性
    [0122] ゲル濾過 H P L C画分 # 2 4のホスホリパーゼ A 2 阻害活 性を測定した。
    [0123] 活性測定系は 1 0 0 ηιΜト リ ス塩酸 （pH9.0 ) 、 4 mM塩化力 ルシゥム、 0. 1 mM 〔 14 C〕 ホスフ ァ チジルエタ ノ ールァ ミ ン
    [0124] ( 2 , 0 0 0 dpm /nmol) 、 及び 1 0〜 1 0 のサ ンブル に蒸留水を加えて全量 2 4 0 にして混合し、 最後に 1 0 P£ の 0. 1 ngZ Wホスホリパーゼ A 2 を加えた。 なお、 ホスホリ バーゼ A2 はラ ッ ト血小板分泌性のもの （炎症局所由来のも のと同一） を用いた。 ボスファチジルエタノ ールアミ ンは
    [0125] (, 4C ] 酢酸を加えた培地中で培養した大腸菌から精製した。 反応は 3 7 'Cで 1 0分間振盪しながら行った。 反応停止及 び脂肪酸の抽出は D 0 1 eの方法にしたがって行い、 抽出し た 〔 14 C〕 脂肪酸を液体シンチ レ一シ ョ ンカ ウ ンタ一で測定 した。
    [0126] 結果を図 5に示した。 本画分は血小板由来ホスホリパーゼ A2 を用量依存的に阻害した。 l ngのホスホリパーゼ八2 活 性を 5 0 %阻害するのに必要な蛋白量は約 5 0 ngであった。 阻害蛋白の分子当量あたりの比活性は血清から精製したラ ッ ト C 3 d g (上述の W◦ 9 1 Z 0 1 9 9 9参照） に比べ約 1 ノ 5であった。 なお、 各種ホスホリバーゼ A2 に対する阻害活性について 試験したところ、 前記ラ ッ ト血清から精製したラ ッ ト C 3 d g と同様にラ ッ ト炎症局所由来ホスホリバーゼ A 2 、 ヒ ト慢 性閬節リ ゥマチ患者関節液由来ホスホ リ バーゼ八2 および Crotalus ada麵 anteus venom ホスホ ひ ノ、·~· ΑΖ には強い阻 害活性を示すものの、 ブタ脾臓ホスホリパーゼ Α2 および Naja naja venom ホスホ リ バ一ゼには全く阻害活性を示さな かった。
    [0127] 例 8 ： ラ ッ ト C TM Cの I g E—抗原ーリ ゾホスフ ァ チジル セリ ン （PS) 依存的活性化に対するラ ッ ト C 3 or融合蛋白の 舰
    [0128] 前記測定法 （ C ) の （ 2 ) で述べた肥満細胞の活性化法に おいて、 抗原およびリゾ P Sと同時に例 5で得られたラ ッ ト C 3 or鎖融合蛋白を加えた。 コ ン ト ロールは、 阻害蛋白を加 えないものについて測定した。 その結果、 第 6図に示したよ う にヒスタ ミ ン遊離が抑制された、 例 7の結果と合わせ、 本 融合蛋白が I I型 P L A2 を阻害することにより ヒスタ ミ ン 遊離を抑制することが明らかとなった。 図中參はコ ン トロー ル、 〇は本蛋白を示す。
    [0129] ヒスタ ミ ン遊離抑制剤である トラニラス 卜が有意なヒスタ ミ ン遊離抑制作用を示すのに必要な濃度は、 それぞれ 1 0 Mであるのに対し、 ラ ッ ト C 3 a鑌融合蛋白の場合には 2.5 X I 0— 7Mであり、 本蛋白が極めて協力な抗ア レルギー反応 抑制作用を有することが明らかになった。 〔産業上の利用可能性〕
    [0130] 本発明のプラスミ ド、 組換え微生物細胞、 それを用いる炎 症局所由来ホスホリパーゼ八2 阻害蛋白の製造方法は、 例え ばアレルギー反応抑制作用を有し、 哺乳動物、 特にヒ トのァ レルギ一疾患の治療薬製造に有用であろう。
    [0131] 〔寄託微生物への言及〕
    [0132] 国際寄託当局 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究 所
    [0133] 住所 ： 日本国茨城県筑波市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305) 寄託番号および日付 ：
    [0134] 1. £ 1 1^8 — 3 0 2 7 ( 1 9 9 0年 4月 2 6 日に寄 託された微ェ研菌寄第 P— 1 1 4 3 1 より移管、 1990 年 4月 2 6 日に受託）
    [0135] 2. F E R M B P— 3 4 8 5 ( 1 9 9 1年 7月 1 7 日に受 託）
    [0136] 3. F E R MB P - 3 4 8 6 ( 1 9 9 1年 7月 1 7 日に受 託）
    [0137] 〔配列表〕
    [0138] 配列番号 ： 1
    [0139] 配列の長さ ： 3 4 4
    [0140] 配列の型 ： ア ミノ酸
    [0141] トポロジー ： 直鎖状
    [0142] 配列の種類 ： タ ンパク質 フ ラグメ ン ト型 ： 中間部フ ラグメ ン ト
    [0143] 配列 ：
    [0144] Glu Asp Val Pro Ala Ala Asp Leu Ser Asp Gin Val Pro Asp Thr 1 5 10 15
    [0145] Asp Ser Glu Thr Arg l ie Leu Leu Gin Gly Thr Pro Val Ala Gin
    [0146] 20 25 30
    [0147] Met Ala Glu Asp Ala Val Asp Gly Glu Arg Leu Lys His Leu l ie
    [0148] 35 40 45
    [0149] Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gin Asn Met l ie Gly Met Thr
    [0150] 50 55 60
    [0151] Pro Thr Val l ie Ala Val His Tyr Leu Asp Gin Thr Glu Gin Trp
    [0152] 65 70 75
    [0153] Glu Lys Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gin Glu Ala Leu Glu Leu l ie
    [0154] 80 85 90
    [0155] Lys し ys Gly Tyr Thr Gin Gin Leu Ala Phe Lys Gin Pro Ser Ser
    [0156] 95 100 105
    [0157] Ala Tyr Ala Ala Phe Asn Asn Arg Pro Pro Ser Thr Trp Leu Thr
    [0158] 110 115 120
    [0159] Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu Ala Ala Asn Leu l ie Ala
    [0160] 125 130 135 l ie Asp Ser Gin Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu l ie Leu
    [0161] 140 145 150
    [0162] Glu Lys Gin Lys Pro Asp Gly Val Phe Gin Glu Asp Gly Pro Val
    [0163] 155 160 165 l ie His Gin Glu Met l ie Gly Gly Phe Arg Asn Thr Lys Glu Ala
    [0164] 170 175 180
    [0165] Asp Val Ser Leu Thr Ala Phe Val Leu l ie Ala Leu Gin Glu Ala
    [0166] 185 190 195
    [0167] Arg Asp l ie Cys Glu Gly Gin Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser He
    [0168] 200 205 210
    [0169] Asn Lys Ala Gly Glu Thr Leu Gl u Ala Ser Tyr Leu Asn Leu Gin
    [0170] 215 220 225
    [0171] Arg Pro Tyr Thr Val Ala l ie Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Leu Met
    [0172] 230 235 240 081 V0V9J,V3991 IVSIVOVraV 3D9I0I00300V9X901VD133V0VVV9I3
    [0173] OZl 993DV93DD3 V99X9X393V D9V33399IV 9V0X399X393330V999Vi 09X03I3XXV 09 3IIV3V0V3V 9V039I9VV00V9IDV0I00 V9V03V09I33VI9IV99VD
    [0174] ： M2歷
    [0175]
    [0176] I I l S y VN CIつ ： 4 : ίι ^ 4 -
    [0177] •J 4乙 ^ φ 4 ^^ ^乙
    [0178] V M M∞ 0 V N a 3 ： 磨 S 0 ½
    [0179] ^ m -一^ a 4
    [0180] 鹩本 z： o
    [0181] mm ·
    [0182] ζ ε o I ：
    [0183] Say jeS OJJ naq SIH naq αθς IB^ dsf ^θ^ asy nsq dsy siq
    [0184] OSS S 028
    [0185] siH dsV 0Jd ΙΒΛ dsy aqx i g Jii ujg eiv ne eiy uif) 9¾d
    [0186] STS Οΐδ SOS
    [0187] i8W slid jqi BIV ui3 jqj, J3S f) αΑχ ΛΙ9 AI9 Ajg JAX SJV
    [0188] 00S 963 062
    [0189] «19 ins usy nsi djj; 3 IB^ οα^ OJJ Ι¾Λ ass ds eqj dsy
    [0190] 082 SiZ
    [0191] Sitq nsq ne naq neq ejy na naq e^v j/ίχ jas Jq e^y n|g 八 usy §J¾ dsy si ος^ o gig
    [0192] BItf Jqi usv 1131 9(id s/iq jqi na αΑ OJJ tqg n^g ne sA us^
    [0193] W)I0/I6df/JDd 6T9S0/Z6O CCCACGGTCA TTGCAGTACA CTATCTGGAT CAGACCGAAC A6TGGGAGAA ATTCGGCCTA 240
    [0194] GAGAAGAGGC AAGAAGCTCT GGAGCTCATC AAGAAAGGGT ACACCCAGCA GCTGGCTTTC 300
    [0195] AAACAGCCCA GCTCTGCCTA TGCTGCCTTC AACAACCGGC CTCCCAGCAC CTGGCTGACA 360
    [0196] GCCTATGTGG TCAAGGTCTT CTCTCTGGCT GCCAACCTCA TCGCCATCGA CTCTCAGGTC 420
    [0197] CTGTGTGGGG CTGTCAAATG GCTGATTCTG GAGAAACAGA AGCCAGATGG TGTCTTTCAG 480
    [0198] GAGGACGGAC CAGTGAHCA CCAAGAAATG ATTGGTGGCT TCCGGAACAC CAAGGAGGCA 540
    [0199] GATGTGTCGC TTACAGCCTT TGTCCTCATC GCACTGCAGG AAGCCAGAGA TATCTGTGAG 600
    [0200] GGGCAGGTCA ACAGCCTTCC CGGGAGCATC AACAAGGCAG GGGAGTATCT TGAAGCCAGT 660
    [0201] TACCTGAACC TGCAGAGACC ATACACAGTA GCCATTGCTG GGTATGCCCT GGCCCTGATG 720
    [0202] AACAAACTGG AGGAACCTTA CCTCACCAAG HTCTGAACA CAGCCAAAGA TCGGAACCGC 780
    [0203] TGGGAGGAGC CTGGCCAGCA GCTCTACAAT GTGGAGGCCA CCTCCTACGC CCTCCTGGCC 840
    [0204] CTGCTGCTGC TGAAAGACTT TGACTCTGTG CCTCCTGTGG TGCGCTGGCT CAACGAGCAA 900
    [0205] AGATACTACG GAGGTGGCTA TGGCTCCACG CAGGCTACCT TCATGGTATT CCAAGCCTTG 960
    [0206] GCTCAATACC AAACAGATGT CCCTGACCAC AAGGACTTGA ACATGGATGT GTCCCTGCAC 1020
    [0207] CTCCCCAGCC GC 1032 配列 号 ： 3
    [0208] 配列の長さ ： 3 4 8
    [0209] 配列の型 ： ア ミ ノ 酸
    [0210] トポ口ジー ： 直鎖状
    [0211] 配列の種類 ： タンパク質
    [0212] フ ラグメ ン ト型 ： 中間部フ ラ グメ ン ト
    [0213] 配列
    [0214] Gl u Gly Val Gin Lys Gl u Asp l ie Pro Pro Al a Asp Leu Ser Asp
    [0215] 1 5 10 15
    [0216] Gin Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr Arg l ie Leu Leu Gin Gl y
    [0217] 20 25 30 Thr Pro Val Ala Gin Met Thr Glu Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg 35 40 45
    [0218] Leu Lys His Leu lie Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gin Asn
    [0219] 50 55 60
    [0220] Met lie Gly Met Thr Pro Thr Val He Ala Val His Tyr Leu Asp
    [0221] 65 70 75
    [0222] Glu Thr Glu Gin Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gin Gly
    [0223] 80 85 90
    [0224] Ala Leu Glu Leu l ie Lys Lys Gly Tyr Thr Gin Gin Leu Ala Phe
    [0225] 95 100 105
    [0226] Arg Gin Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg Ala Pro
    [0227] 110 115 120
    [0228] Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu Ala
    [0229] 125 130 135
    [0230] Val Asn Leu l ie Ala l ie Asp Ser Gin Val Leu Cys Gly Ala Val
    [0231] 140 145 150
    [0232] Lys Trp Leu l ie Leu Glu Lys Gin Lys Pro Asp Gly Val Phe Gin
    [0233] 155 160 165
    [0234] Glu Asp Ala Pro Val l ie His Gin Glu Met l ie Gly Gly Leu Arg
    [0235] 170 175 180
    [0236] Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala し eu Thr Ala Phe Val Leu l ie
    [0237] 185 190 195
    [0238] Ser し eu Gin Glu Ala Lys Asp lie Cys Glu Glu Gin Val Asn Ser
    [0239] 200 205 210
    [0240] Leu Pro Gly Ser He Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn
    [0241] 215 220 225
    [0242] Tyr Met Asn Leu Gin Arg Ser Tyr Thr Val Ala l ie Ala Gly Tyr
    [0243] 230 235 240
    [0244] Ala Leu Ala Gin Met Gly Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys
    [0245] 245 250 255
    [0246] Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly
    [0247] 260 265 270
    [0248] Lys Gin Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala
    [0249] 275 280 285 Leu Leu Gin Leu Lys Asp Phe Asp Phe Val Pro Pro Val Val Arg 290 295 300
    [0250] Trp Leu Asn Glu Gin Arg Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr
    [0251] 305 310 315
    [0252] Gin Ala Thr Phe Met Val Phe Gin Ala Leu Ala Gin Tyr Gin Lys
    [0253] 320 325 330
    [0254] Asp Ala Pro Asp His Gin Glu Leu Asn Leu Asp Val Ser Leu Gin
    [0255] 335 340 345
    [0256] Leu Pro Ser Arg 配列番号 ： 4
    [0257] 配列の長さ ： 1 0 4 7
    [0258] 配列の型 ： 核酸
    [0259] 鎖の数 ： 2本鎖
    [0260] トボロ ジー ： 直鎖状
    [0261] 配列の種類 ： c D N A to m R N A
    [0262] フ ラグメ ン ト型 ： 中間部フ ラグメ ン ト
    [0263] 直接の起源
    [0264] • ラ イ ブラ リ一名 ： ヒ ト c D N Aク ロー ン p H L C 3. 1 1 ' ク ロー ン名 ： P T H C 3 Z 1. 0 5 0
    [0265] 配列 ：
    [0266] GAAGGAGTGC AGAAAGAGGA CATCCCACCT GCAGACCTCA GTGACCAAGT CCCGGACACC
    [0267] GftGTCTGAGA CCAGAATTCT CCTGCftAGGG ACCCCAGTGG CCCAGATGftC AGAGGATGCC
    [0268] GTCGACGCGG AACGGCTGAA GCACCTCATT GTGACCCCCT CGGGCTGCGG GGAACAGAAC ATGATCGGCA TGACGCCCAC GGTCATCGCT GTGCATTACC TGGATGAAAC GGAGCAGTGG GAGAAGTTCG GCCTAGAGAA GCGGCAGGGG GCCTTGGAGC TCATCAAGAA GGGGTACACC CAGCAGCTGG CCTTCAGACA ACCCAGCTCT GCCTTTGCGG CCTTCGTGAA ACGGGCACCC
    [0269] S/Z6 OAi 6I9/IDd/ef isdI
    [0270] 震S cしf83x J謹 31 。3国 333_3V- 籠iii謹 霧 3 v3 8 Bv。 V謹v
    [0271] ¾SV麵S謹M3 D3謹 § 3 I S3謹〇333s∞
    [0272] V謹 83VV3V C3
    [0273] C_3
    [0274] s¾3H3謹 33V33 3V Sis33s¾義
    [0275] CO βενΪ83ν 33H 33
    [0276] 鐘謹 3。
    [0277] 1誠11謹。 83謹 1 l。画
    [0278] 6
    [0279] Ϊ3V33¾§ 3S 3
    [0280] iis i一
    [0281] 6=i
    [0282] «3：
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. 炎症局所由来ホスホ リバーゼ八2 阻害蛋白をコー ドす る D NA配列と、 この蛋白の発現調節を行うプロモーター機 能を有する D N A配列とを舍んでなるプラスミ ド。
    2. 前記阻害蛋白をコー ドする D NA配列が、 ラ ッ トまた はヒ トに由来する請求項 1記載のプラスミ ド。
    3. 前記阻害蛋白をコードする D N A配列が、 配列番号 1 に示すア ミノ酸配列またはこの配列において 1以上のァ ミノ 酸残基が置換、 欠失もしく は新たに挿入されたァ ミノ酸配列 を舍む蛋白をコー ドする D N A配列である請求項 1記載のプ ラ ス ミ ド。
    4. 前記阻害蛋白をコードする D NA配列が、 配列番号 3 に示すア ミノ酸配列またはこの配列において 1以上のァ ミノ 酸残基が置換、 欠失もしく は新たに揷入されたァ ミノ酸配列 である請求項 1記載のプラスミ ド。
    5. 前 阻害蛋白をコー ドする D N A配列が、 配列番号 2 に示す D N A配列である請求項 3記載のプラ ス ミ ド。
    6. 前記阻害蛋白をコードする D N A配列が、 配列番号 4 に示す D N A配列である請求項 4記載のプラス ミ ド。
    7. 前記阻害蛋白をコードする D N A配列が、 ラ ッ ト肝 c D N A A g t 1 1 ラ イ ブラ リ ーに由来する 2. l kbp の D N A 断片であって、
    前記 D N A断片が、 c D N A l g t l l ライブラ リーを E c 0 R I で消化して得られる 2. 0 kbp の D N A断片と、 も う一つの 0.7 kbp の D NA断片を B a m H Iで消化して得ら れる 0. I kbp の D N A断片から再構築されたものである、 請求項 5記載のプラスミ ド。
    8. 前記阻害蛋白をコードする D N A断片が、 請求項 7記 載の 2.0 kbp の DNA断片に由来し、 この DNA断片を F o k I消化することによって得られる 1.0 kbp の E c 0 R I - F 0 k I断片の上流域に開始コ ドンの下流にラ ツ ト C 3 d g 遣伝子の 5 ' 末端 5 9をつなげて調製した 2本鎖 D N Aをラ ィゲーショ ンし、 下流域に終止コ ドンの上流にラ ッ ト C 3 d g遺伝子の 3 ' 末端 1 4 bpをつなげて調製した 2本鎖 D N A をライゲーショ ンして再構築した D N A配列である請求項 1 記載のプラスミ ド。
    9. 前記阻害蛋白をコードする D N A断片が、 ヒ ト c D N Aクローン p H L C 3.1 1に由来し、 この c D NAクローン を E c o R Iおよび K p n lで消化して得られる約 1.2 kbの E c o R I -K p n l断片の上流域に、 開始コ ドンと C 3 d g遺伝子の 5 ' 末端約 7 0 bpをつなげて調製した 2本鎖 D N Aの N c 0 I — E c o R I断片をライゲーシヨ ンし、 さ らに この DNA断片を E c 0 T 1 Iで部分消化して得られる約 0.9 7 の N c o l — E c o T 1 4 I断片の下流域に、 ヒ ト C 3 d g遺伝子の 3 ' 末端約 8 0 bpと終止コ ドンをつなげて 調製した 2本鎮 D NAの E c o T 1 4 I — K p n l断片をラ ィゲ一ショ ンして再構築した D N A配列である請求項 1記載 のプラス ミ ド。
    10. プラスミ ドが P P T C 3ノ 2. 1 , p T R C 3 / 1, 0 3 5および P T H C 3 / 1.0 5からなる群より選ばれる 請求項 1記載のプラスミ ド。
    11. 請求項 1記載のプラスミ ドによって形質転換された組 換え微生物細胞。
    12. 宿主細胞が Eschericia属に属する微生物細胞である請 求項 1 1記載の組換え微生物細胞。
    13. 宿主細胞が Eschericia coli JM109 である請求項 1 1 記載の組換え微生物細胞。
    14. 前記微生物細胞が Eschericia coli PTC 3 /2. 1 , J 9 T H C 3 / 1. 0 3 5および J 9 T H C 3ノ 1.0 5 0から なる群より選ばれる請求項 1 3記載の組換え微生物細胞。
    15. 請求項 1 1記載の組換え微生物細胞を栄養培地で炎症 局所由来ホスホリパーゼ八2 阻害蛋白を生成するまで培養し, 培養物から該炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋 Sを採 取することを特徴とする炎症局所由来ホスホリパーゼ八2 阻 害蛋 Sの製造方法。
    16. 前記組換え微生物細胞が請求項 1 4記載のものである 請求項 1 5記載の方法。
    17. 請求項 1 5記載の製造方法で製造された炎症局所由来 ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白。
    18. 請求項 1 6記載の製造方法で製造された請求項 1 7記 載の炎症局所由来のホスホ リ パーゼ A2 阻害蛋白。
    19. 炎症局所由来ホスホリパーゼ八2 阻害蛋白を有効成分 として舍んでなるァレルギ一反応抑制剤。
    20. 炎症局所由来ホスホリパーゼ Az 阻害蛋白が請求項 1 7記載の阻害蛋白である請求項 1 9記載のア レルギー反応 抑制剤。
    21. 前記ァレルギ一反応が即時型ァレルギ一反応である請 求項 1 9記載の抑制剤。
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    JP3207429B2|2001-09-10|蛋白質の修飾方法
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0495995A1|1992-07-29|
    CA2067237A1|1992-02-04|
    EP0495995A4|1994-04-13|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1992-02-20| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CA JP KR US |
    1992-02-20| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IT NL SE |
    1992-03-31| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 2067237 Country of ref document: CA |
    1992-04-06| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1991913830 Country of ref document: EP |
    1992-07-29| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1991913830 Country of ref document: EP |
    1995-09-04| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1991913830 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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